簡介：

吲哚菁綠（ICG）是一種用于醫(yī)學(xué)診斷的花青染料。它用于確定心輸出量，肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。它具有接近800nm的峰值光譜吸收。這些紅外線頻率穿透視網(wǎng)膜層，使ICG血管造影成像比熒光血管造影更深的循環(huán)模式.ICG與血漿蛋白緊密結(jié)合，變得局限于血管系統(tǒng)。 ICG的半衰期為150至180秒，僅通過肝臟從膽汁液中排出。近期的一項研究表明，ICG在注射后20分鐘內(nèi)靶向動脈粥樣硬化，并提供足夠的信號增強，用于體內(nèi)檢測動脈粥樣硬化兔中富含脂質(zhì)的，發(fā)炎的，冠狀動脈大小的斑塊。離體熒光反射成像顯示，與注射鹽水的動脈粥樣硬化兔相比，注射ICG的動脈粥樣硬化兔的斑塊靶 - 背景比高。氨基反應(yīng)性ICG衍生物用于與抗體和其他生物分子制備ICG生物綴合物。所有ICG染料都需要溶解在DMSO中用于標記用途。

存儲和處理

收到后，ICG染料應(yīng)儲存在<-15℃，并避免光照和潮濕。ICG染料的重構(gòu)DMSO儲備溶液可以在<-15℃下儲存不到兩周。蛋白質(zhì)綴合物應(yīng)在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。當在2mM疊氮化鈉存在下保存并且避光時，綴合物溶液可以在4℃下儲存兩個月而沒有顯著變化。對于更長時間的儲存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-60℃下儲存，并避光。

物理化學(xué)特性

注釋1.吸收波長處的消光系數(shù); 2. 260 nm處的CF是用于消除染料在260 nm處對吸光度的貢獻的校正因子（用于寡核苷酸和核酸標記）; 3. 280 nm處的CF是用于消除染料對280 nm處吸光度的貢獻的校正因子（用于肽和蛋白質(zhì)標記）; 5.與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后熒光強度顯著增加。

染色細胞分析

注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與ICG的綴合物開發(fā)的。 您可能需要進一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。

操作步驟

1.準備蛋白質(zhì)儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL 給予1 mL蛋白質(zhì)標記原液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。 如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。 如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好地標記。 疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。 可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標記結(jié)果。

注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會顯著降低。 為獲得標記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B）。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標記可能不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標記染料溶液重復(fù)步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2運行綴合反應(yīng)（參見下面的步驟4）。

3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）（見下頁）。

3.6運行上述4種結(jié)合物的功能測試，確定染料/蛋白質(zhì)比例，以擴大標記反應(yīng)。

4.運行結(jié)合反應(yīng)：

4.1在有效搖動下，將適量的染料儲備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級分。

注1：立即使用時，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。

表征所需的染料 - 蛋白質(zhì)綴合物

取代度（DOS）是表征染料標記蛋白質(zhì)的重要因素。 較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強度，但較高DOS（例如DOS> 6）的蛋白質(zhì)也傾向于具有減少的熒光。 根據(jù)染料和蛋白質(zhì)的特性，大多數(shù)抗體的DOS建議在2到10之間。 為了有效標記，應(yīng)將取代度控制為對于1摩爾抗體具有4-10摩爾的ICG。 以下步驟用于確定ICG標記蛋白的DOS。

2.讀取280nm處的OD（吸光度）和染料吸收（ICG染料的?max= 785nm）：

對于大多數(shù)分光光度計，樣品（來自柱級分）需要用去離子水稀釋，使得OD值在0.1至0.9的范圍內(nèi)。 280nm處的O.D.（吸光度）是蛋白質(zhì)的極大吸收，而785nm是ICG染料的極大吸收。 為了獲得準確的DOS，確保綴合物不含非共軛染料。

3. 使用以下等式計算DOS：

[Dye]是染料濃度，并且可以根據(jù)Bee-Lambert定律容易地計算：A =εdyeCL。 [protein]是蛋白質(zhì)濃度。 如果共軛效率足夠高（優(yōu)選> 70％）或通過比爾 - 朗伯定律更準確地計算，則該值可以通過重量（加入反應(yīng)）估算：A =ε蛋白質(zhì)CL。 例如，IgG的ε值為203,000cm-1M-1.Pε280= 280nm處的蛋白質(zhì)摩爾消光系數(shù)（例如IgG的摩爾消光系數(shù)為203,000cm-1M-1）。 對于ICG-Sulfo-OSu，CF（280nm處的染料吸收校正因子）= OD280 / OD750 = 0.073。 230,000cm-1M-1是ICG-Sulfo-OSu的摩爾消光系數(shù)。

參考文獻

1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York. 2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.

3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjug Chem 3, 2-13.