產(chǎn)品簡(jiǎn)介

膽固醇，是建立和維持細(xì)胞的必需品。它在生理溫度范圍內(nèi)調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性。在細(xì)胞內(nèi)，膽固醇是幾種生化途徑中的前體分子。膽固醇也是合成維生素D和類固醇**的重要前體分子，包括腎上腺**皮質(zhì)醇和醛固酮以及性**黃體酮，雌**，睪酮及其衍生物。

Amplite?熒光膽固醇定量試劑盒是量化膽固醇*敏感的方法之一。該試劑盒使用Amplite?Red來(lái)定量膽固醇濃度，這與膽固醇氧化酶介導(dǎo)的酶偶聯(lián)反應(yīng)中膽固醇存在時(shí)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生有關(guān)。膽固醇的量與酶偶聯(lián)反應(yīng)循環(huán)中形成的過(guò)氧化氫的濃度成比例。在存在過(guò)氧化物酶的情況下，Amplite ^TM Red的熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)化為膽固醇濃度的過(guò)氧化氫濃度成比例?？梢杂?/span>Ex / Em = ~540 / 590nm的熒光酶標(biāo)儀容易地讀取測(cè)定法。

試劑盒套件

96孔板實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1. 準(zhǔn)備測(cè)定反應(yīng)混合物（50μL）®

2. 添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）®

3. 在室溫或37°C培養(yǎng)30分鐘®

4. 在Ex / Em = 540/590 nm處監(jiān)測(cè)熒光增加

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，將所有試劑盒組分解凍至室溫。

操作步驟

1.準(zhǔn)備Amplite?Red原液（250X）：

將40μLDMSO（組分E）加入Amplite?Red小瓶（組分A）中。應(yīng)立即使用原液。 需要將任何剩余的溶液等分并在-20°C下重新冷凍。

注1：避免反復(fù)凍融循環(huán)。 

注2：在硫醇如二硫蘇糖醇（DTT）和2-巰基乙醇存在下，Amplite?Red不穩(wěn)定。反應(yīng)中DTT或2-巰基乙醇的*終濃度應(yīng)不高于10μM。 Amplite?Red在高pH（> 8.5）下也不穩(wěn)定。反應(yīng)應(yīng)在pH 7-8下進(jìn)行。建議使用提供的pH 7.4的分析緩沖液。

2.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（0至10μM）：

2.1將10μL2mM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（組分D）加入990μL測(cè)定緩沖液（組分B）中，產(chǎn)生20μM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2取300μL20μM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀釋膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3如表1和2所述，將連續(xù)稀釋的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品和/或含膽固醇的測(cè)試樣品加入固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注：根據(jù)需要處理樣品。

表1.固體黑色96孔微孔板中膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的排布

注意：CHL =膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品

表2.每個(gè)孔的試劑組成

注意：將連續(xù)稀釋的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品從0到10μM添加到CHL1到CHL7的孔中，一式兩份。

3.準(zhǔn)備測(cè)定反應(yīng)混合物：

3.1將5 mL測(cè)定緩沖液（組分B）加入膽固醇酶混合物（組分C）瓶中，并充分混合。

3.2將20μL的Amplite Red?原液（250X，來(lái)自步驟1）加入膽固醇酶混合瓶中（來(lái)自步驟3.1）。

4.運(yùn)行膽固醇測(cè)定：

4.1將50μL測(cè)定反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟3.2）加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見(jiàn)步驟2.3，表1），使總膽固醇測(cè)定體積為100μL/孔。 

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μL測(cè)定反應(yīng)混合物。

4.2在室溫或37°C培養(yǎng)反應(yīng)30分鐘，避光。

4.3使用熒光板讀寫器監(jiān)測(cè)Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm處的熒光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm處*佳）。

注意：也可將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標(biāo)儀在576×5nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。

數(shù)據(jù)分析

空白孔中的熒光（僅含測(cè)定緩沖液）用作對(duì)照，并從具有膽固醇反應(yīng)的那些孔的值中減去。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

注意：熒光背景隨時(shí)間增加，因此減去每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的空白孔的熒光強(qiáng)度值很重要。