鈣黃綠素（Calcein AM）是用于標(biāo)記和監(jiān)測活細(xì)胞細(xì)胞功能的*流行的熒光探針之一。但，Calcein AM的有限顏色選擇及其與GFP的完全光譜重疊使得這種試劑無法用于多色分析。

百螢生物為您推薦AAT Bioquest研發(fā)的Calcein Red?，Calcein Orange?和CytoCalcein?它們可以用于多重細(xì)胞功能分析，顏色多樣。它們?cè)谶M(jìn)入活細(xì)胞時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光。Calcein Red?，Calcein Orange?和CytoCalcein?是疏水性化合物，可輕易滲透完整的活細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)酯酶誘導(dǎo)的水解后產(chǎn)生各自的細(xì)胞保留的熒光團(tuán)。通過流式細(xì)胞術(shù)，熒光酶標(biāo)儀和熒光顯微鏡獲得一致的結(jié)果。即使在Jurkat細(xì)胞中染色加載2周后，Calcein Orange?和CytoCalcein?也具有*小的細(xì)胞毒性，而在用相同濃度的鈣黃綠素AM染色加載3天后，所有細(xì)胞都是凋亡/壞死的。

材料與步驟

1.將CHO-M1，CPA和Jurkat細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中在96孔黑壁/透明底板中鋪板過夜。

2.染料加載：孵育過夜后，除去培養(yǎng)基。 2-5μM鈣黃綠素，AM（Cat＃22004），Calcein Orange?（Cat＃22009），Calcein Red?（Cat＃22010），Calcein blue，AM（Cat＃22007），CytoCalcein?Violet 450（Cat＃22012） 將100μL含有20mM HEPES的1X HBSS中的CytoCalcein?Violet 450（Cat＃22012）加入每個(gè)孔中。 將細(xì)胞在37℃下染色15至30分鐘。 在染料加載后，用緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。

3. 在熒光顯微鏡（Olympus IX71），BMG NOVOstar酶標(biāo)儀或FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果分析

圖1.用不同鈣黃綠素染色的96孔Costar黑墻/透明底板中的CPA細(xì)胞圖像。 A：Calcein，AM（FITC），B：Calcein Orange?（TRITC），C：Calcein Red?（Cy5），D：Calcein blue，AM（DAPI），E：CytoCalcein?Violet 450（Ex / Em = 405 / 450nm，405紫羅蘭），F(xiàn)：CytoCalcein? Violet 500（Ex / Em = 405 / 500nm，405紫羅蘭）。

圖2.用Calcein AM，Calcein Orange?，Calcein Red?和CytoCalcein?測量Jurkat細(xì)胞數(shù)反應(yīng)。 將0至50,000個(gè)細(xì)胞/孔/100μL的Jurkat細(xì)胞接種在96孔黑色壁/透明底Costar板中。 將細(xì)胞與每種5μM的鈣黃綠素一起在37℃溫育1小時(shí)。 在Ex / Em = 490 / 525nm（A，Calcein，AM），485 / 540nm（B，Calcein Orange?），590 / 670nm（C，Calcein Red?）和405/450下測量熒光強(qiáng)度。 nm（D，CytoCalcein?Violet 450），使用NOVOstar儀器（來自BMG Labtech）

圖3.鈣黃綠素，AM和Calcein Red?在CPA細(xì)胞上的光漂白比較。 將CPA細(xì)胞以30,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔Costar黑壁/透明底板中過夜，將2-5μM鈣黃綠素，AM或Calcein Red?在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。 用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡（Olympus IX71）測量熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系。 A和B：Calcein，AM在0和120秒曝光時(shí)間（FITC）C和D：Calcein Red?在0和120秒曝光時(shí)間（Cy5）。

圖4.鈣黃綠素，AM和Calcein Orange?對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的比較。 將Jurkat細(xì)胞用5μM的鈣黃綠素，AM或Calcein Orange?在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中染色30分鐘，然后用生長培養(yǎng)基洗滌。 將載有染料的細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。 在染料加載后每天用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡（Olympus IX71）測量熒光強(qiáng)度.A和B：鈣蛋白，在染料加載后第1天和第3天的AM（FITC）C和D：鈣黃綠素橙 染料加載后第1天和第3天（TRITC）。

圖5.通過鈣黃綠素AM，CytoCalcein ?Violet 450，Calcein Orange?和Calcein Red?監(jiān)測的CPA細(xì)胞細(xì)胞毒性的比較。 將CPA細(xì)胞用25％乙醇處理30分鐘，然后使用未處理的對(duì)照染料加載不同的染料。 用NOVOstar酶標(biāo)儀（BMG Labtech）讀取熒光。

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