DNA 片段化代表晚期細胞凋亡的特征。我們的 Cell Meter? TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒使用專有的不含二甲胂酸鈉的緩沖系統(tǒng)。該試劑盒基于將我們獨特的專有熒光染料摻入細胞凋亡過程中形成的 DNA 片段中。該測定法經(jīng)過優(yōu)化，可在不使用抗體的情況下直接檢測分離或附著細胞的細胞凋亡。該試劑盒提供了所有基本成分和優(yōu)化的檢測方案。

實驗方案如下：

簡要概述

1. 用測試化合物準備細胞。

2. 與TUNEL工作溶液在37°C下孵育30分鐘至1小時。

3. 洗滌細胞。

4. 用4％甲醛（可選）固定細胞。

5. 用帶FITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FITC通道的流式細胞儀。讀取Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）處的熒光強度。

注意：在開始實驗之前， 在室溫下解凍所有組件。

工作溶液配制

將0.5μL的100X Tunnelyte Green（組分A）添加到50μL的反應(yīng)緩沖液（組分B）中，使總體積為50.5μL的TUNEL工作溶液。 避光。 注意：應(yīng)單獨評估每個細胞系，以確定細胞密度。

實驗步驟

1.根據(jù)您的特定協(xié)議，將細胞培養(yǎng)至密度以誘導凋亡。 對于在96孔板培養(yǎng)物中生長的貼壁細胞，我們建議大約30,000至50,000個細胞/孔，對于非貼壁細胞，建議大約1至2 x 106細胞/ mL。 同時，在每種標記條件下，用誘導群體相同的密度培養(yǎng)非誘導陰性對照細胞群體。 注意：我們用100 nM-1 μM星形孢菌素處理HeLa細胞4小時，以誘導細胞凋亡。

2.染色和固色：

2.1取出細胞培養(yǎng)基。
2.2向每個樣品中添加50μL TUNEL工作溶液。
2.3在37°C下孵育30-60分鐘。
2.4除去TUNEL工作溶液，并用200 μL /孔的PBS洗滌細胞1-2次。
2.5向每個樣品中添加100uL反應(yīng)緩沖液（組分B）。
2.6使用Ex / Em = 550/590-650 nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細胞儀檢測熒光強度。
2.7可選：從步驟5中移出反應(yīng)緩沖液，并向每個孔中添加100 μL /孔/ 96孔板的4％甲醛固定緩沖液（未提供）。注意：對于非貼壁細胞，請?zhí)砑铀枇浚ɡ?X106細胞/ mL）的4％甲醛固定液。
2.8在室溫下將平板孵育20至30分鐘。
2.9去除固定劑。
2.10用PBS洗滌細胞2-3次，并用100μL PBS /孔/ 96孔板替換。
2.11使用Ex / Em = 550/590-650nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細胞儀檢測熒光強度。

2.12可選：用1X Hoechst（組分C）在Ex / Em = 350/460 nm處染色細胞核，以進行圖像分析

圖為Cell Meter TUNEL凋亡檢測試劑盒紅色熒光光譜圖