鈣離子熒光探針Fluo-3, AM是美國AAT生產(chǎn)的用于鈣通量測定的試劑，鈣通量測定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的藥品發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。 我們的Quest Fluo-8 和Rhod-4 系列鈣檢測試劑是亮的綠色和紅色鈣指示劑。 我們的其他鈣指標(biāo)如Fluo-3，F(xiàn)ura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM也具有與市場上相比高的質(zhì)量。百螢生物是AAT Bioquest 的中國代理商，為您提供的鈣離子熒光探針。
產(chǎn)品說明書
操作步驟
1.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：
AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。 該方案僅提供指南，實際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。
a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。
b）在實驗當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。使?.02％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的濃度為4-5 uM。細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號強(qiáng)度的小探針濃度。
c）如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標(biāo)的泄漏。在室溫或37°C下用鈣指示劑酯孵育細(xì)胞20分鐘至1小時。
d）在HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如2.5mM丙磺舒，如果適用）中洗滌細(xì)胞1-2次以除去過量的探針。
e）在所需的Ex / Em波長下進(jìn)行實驗。
2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：
為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]
其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。 解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca2 +結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。 說明書中的表1列出了一些鈣試劑的Kd值供您參考。