5-Propargylamino-3'-azidomethyl-dCTP是制備用于下一代測序（NGS）的熒光綴合物的關(guān)鍵組成部分。 NGS使用與早期Sanger測序相似的鏈終止方法，但NGS是通過熒光標(biāo)記的核苷酸類似物作為擴(kuò)增反應(yīng)的可逆終止劑來進(jìn)行的。 NGS依賴于可逆的DNA聚合阻斷，而Sanger測序則使用ddNTP不可逆轉(zhuǎn)的DNA聚合阻斷。 NGS的另一個(gè)不同特征是通過橋式PCR進(jìn)行體外克隆擴(kuò)增以增加待測序分子的數(shù)量。在此平臺(tái)上，片段與固定在固體表面上的引物連接，進(jìn)行原位擴(kuò)增，生成具有相同分子的DNA簇。在每個(gè)循環(huán)中，同時(shí)添加可逆終止的四個(gè)核苷酸，并通過它們互補(bǔ)的聚合酶摻入。通過將3'-OH基團(tuán)替換為3'-o-疊氮基甲基，這些核苷酸被化學(xué)封閉，以防止聚合酶在每個(gè)循環(huán)中摻入一個(gè)以上的核苷酸。摻入核苷酸后，在不同通道中針對(duì)不同堿基測量熒光信號(hào)。關(guān)于下一循環(huán)，洗滌未摻入的核苷酸，并用TCEP去除3'端的化學(xué)封鎖。一旦收集到熒光信號(hào)，就會(huì)開始一個(gè)新的循環(huán)，重復(fù)此動(dòng)態(tài)過程，直到完成每個(gè)片段的測序?yàn)橹??？傊琋GS測序反應(yīng)分三個(gè)步驟進(jìn)行：核苷酸的添加，成像和通過熒光團(tuán)裂解的3'-OH再生。