樣品實(shí)驗(yàn)方案
簡要概述
1.平板細(xì)胞并根據(jù)需要處理細(xì)胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分鐘
3.洗滌細(xì)胞并裂解細(xì)胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室溫下孵育30至120分鐘
6.監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光增加
溶液配制
1.儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
KRPH緩沖液原液（1X）：
將20mL KRPH緩沖液（5X）（組分H）加入到80mL去離子水中并充分混合。 注意：對于大約一個96孔板，50 mL體積的1×KRPH緩沖液就足夠了。 按比例準(zhǔn)備所需的音量。 將未使用的1×KRPH存放在4oC或-20oC。
2.工作溶液配制
1. NADP工作溶液：
將100μLH2O加入到NADP（組分G）的小瓶中并充分混合。
2.酶探針工作溶液：
將5mL測定緩沖液（組分F）加入酶探針瓶（組分E）中并充分混合。
3. 2-DG攝取分析工作溶液：
將100μL的NADP工作溶液加入酶探針工作溶液中并充分混合。 注意：這些數(shù)量適用于一個96孔板。
操作步驟
重要提示：該方案可用作培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞用于2-DG攝取的指導(dǎo)。
1.在生長培養(yǎng)基中以50,000-80,000細(xì)胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000細(xì)胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底細(xì)胞培養(yǎng)Poly-D賴氨酸平板培養(yǎng)4-6小時。
2.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，從孔中吸出培養(yǎng)基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）無血清培養(yǎng)基除去細(xì)胞。將細(xì)胞在37oC，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育6小時至過夜。
3.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，從孔中吸出培養(yǎng)基，用100μL/孔1×KRPH緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞兩次。
4.加入90μL/孔葡萄糖攝取緩沖液（組分B）并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞1小時。
5.用或不用胰島素或試驗(yàn)化合物刺激20分鐘。加入10μL/孔的10×胰島素溶液至終濃度為1μM或10×化合物測試溶液。并且還向未處理的孔中加入10μL胰島素載體緩沖液或復(fù)合載體緩沖液作為對照，并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20分鐘。
6.對于葡萄糖攝取抑制研究，加入10×Phloretin至終濃度為200 uM或測試抑制劑，并在37oC，5％CO2下孵育2-5分鐘。注意：建議將10mL抑制劑載體緩沖液加入胰島素處理和未處理的孔中作為對照。 Phloretin處理的細(xì)胞可用作陽性對照。
7.向每個孔中加入10μL/孔2-DG溶液（組分A），并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20-40分鐘。對于陰性對照，留下一些未經(jīng)胰島素，抑制劑和2-DG處理的孔。
8.處理后，取出每孔中的溶液，用KRPH緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，100μL/孔，從溶液中除去額外的2-DG。從孔中移除KRPH緩沖液。
9.向每個孔中加入25μL/孔酸性裂解緩沖液（組分C），并在37℃下孵育20分鐘以裂解細(xì)胞。并且可以同時制備2DG攝取測定混合物。
10.向每個孔中加入25μL/孔中和緩沖液（組分D），充分混合，在室溫下放置5-10分鐘以中和細(xì)胞裂解物。
11.向2DG6P標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)胞裂解液的每個孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。
12.在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘至2小時，避光。
13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm處截止）。