簡(jiǎn)介

肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。 肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞中兩種細(xì)絲的單體亞基：細(xì)絲，細(xì)胞骨架的三個(gè)主要成分之一，以及細(xì)絲，是肌細(xì)胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞過程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂，囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

我們的鬼筆環(huán)肽綴合物選擇性地結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白。用于納摩爾濃度的鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標(biāo)記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織中的F-肌動(dòng)蛋白切片，細(xì)胞培養(yǎng)或無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。鬼筆環(huán)肽比肌動(dòng)蛋白更緊密地結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲單體，基本上導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從長(zhǎng)絲末端解離的速率常數(shù)降低通過防止長(zhǎng)絲解聚來穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽可抑制鬼筆環(huán)肽F-肌動(dòng)蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中以不同濃度起作用不同。介紹時(shí)在低濃度的細(xì)胞質(zhì)中，鬼筆環(huán)肽募集較少聚合形式的細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白和細(xì)絲蛋白進(jìn)入聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島”，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即厚的束微絲。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是通過標(biāo)記研究細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白分布的有用工具鬼筆環(huán)肽與熒光類似物并用它們?nèi)旧?dòng)蛋白絲用于光學(xué)顯微鏡檢查。熒光衍生物鬼筆環(huán)肽已經(jīng)證明非常適用于定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及用于定位肌動(dòng)蛋白絲在體外可視化單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作該中的重要工具

肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的高分辨率研究。 AAT Bioquest提供各種熒光鬼筆環(huán)肽衍生物用于多色成像應(yīng)用的不同顏色，如下表所示。

光譜特性

鬼筆環(huán)肽綴合物的激發(fā)和發(fā)射值總結(jié)在下表中

*由于其基本相同的光譜特性，優(yōu)異地替代德克薩斯紅鬼筆環(huán)肽綴合物。

儲(chǔ)存和處理?xiàng)l件

熒光鬼筆環(huán)肽綴合物是DMSO中的1000X儲(chǔ)備溶液或凍干粉末。 如果儲(chǔ)存在-20°C，溶液和粉末應(yīng)穩(wěn)定至少6個(gè)月。 保護(hù)熒光共軛物免受光照，并避免凍/融循環(huán)。

注意：鬼筆環(huán)肽是有毒的，雖然小瓶中存在的**量只能對(duì)蚊子致死（鬼筆環(huán)肽的LD50 = 2 mg / kg），但應(yīng)小心處理。

分析方案

簡(jiǎn)要總結(jié)

在微孔板孔中準(zhǔn)備樣品®

從板中的樣品中去除液體®

添加鬼筆環(huán)肽-iFluor?溶液（100μL/孔）®

在室溫下染色細(xì)胞20到90分鐘®

洗滌細(xì)胞®

在顯微鏡下檢查樣品

注意：將小瓶加熱至室溫并在打開前短暫離心

操作步驟

1. 制備1000 X鬼筆環(huán)肽DMSO儲(chǔ)備液：將30μLDMSO加入粉末形式的小瓶中。

2. 制備1X鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液：通過將1μL1000X鬼筆環(huán)肽綴合物DMSO溶液加入1mL含1％BSA的PBS中。

注1：鬼筆環(huán)肽綴合物的未使用的1000X DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)等分并儲(chǔ)存在-20℃，避光保存。

注2：不同的細(xì)胞類型可能染色不同。 應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液的濃度。

3. 染色細(xì)胞：

3.1進(jìn)行甲醛固定。 在室溫下將含有3.0-4.0％甲醛的細(xì)胞在PBS中孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含甲醇的固定劑，因?yàn)榧状紩?huì)在固定過程中破壞肌動(dòng)蛋白。 優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

3.2用PBS沖洗固定的細(xì)胞2-3次。

3.3可選：將0.1％Triton X-100在PBS中加入固定細(xì)胞（來自步驟2.2）3至5分鐘，以增加滲透性。 用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。

3.4將100μL/孔（96孔板）的鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)物工作溶液（來自步驟1）加入固定的細(xì)胞（來自步驟2.2或2.3），并在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘。

3.5用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2至3次以除去過量的鬼筆環(huán)肽結(jié)合物，然后在顯微鏡下進(jìn)行電鍍，密封和成像。

參考文獻(xiàn)

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