基本信息
貨號：15261
儲存條件：保存在冰箱里，避光
適用儀器：吸光板酶標(biāo)儀
簡介
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是一種在光合作用的初步反應(yīng)中很重要的氧化劑。 通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。
現(xiàn)有的NAD / NADH方法具有低靈敏度和高干擾，因為測定在UV范圍內(nèi)進(jìn)行。 我們的Amplite?比色總NAD和NADH檢測試劑盒為敏感檢測NAD和NADH提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在較長波長范圍內(nèi)進(jìn)行，這顯著降低了生物樣品引起的干擾。 也沒有必要從樣品混合物中純化NAD / NADH。 該試驗證明了高靈敏度和低約576nm處吸光度的干擾。
Amplite?比色NAD / NADH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測，可在100μL檢測體積（300 nM;圖1）中檢測少至30皮摩爾的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測定。 其信號可通過吸光度酶標(biāo)儀在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下輕松讀取，以提高測定靈敏度。
試劑盒特點
廣泛應(yīng)用：可用于量化溶液和細(xì)胞提取物中的NAD / NADH。
敏感：在溶液中檢測低至30皮摩爾的NAD / NADH。
連續(xù)性：無需分離步驟即可輕松適應(yīng)自動化。
方便：配方具有極小的手動操作時間。 不需要洗滌。
非放射性：對廢物處理沒有特殊要求。
試劑盒組成
96孔板的檢測方案
簡要概括
準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物（50μL）®
添加NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）®
在室溫下孵育15分鐘 - 2小時®
監(jiān)測吸光度在575±5 nm處增加
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。
操作步驟
1.準(zhǔn)備NADH儲備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol /μL）NADH儲備溶液。
注意：未使用的NADH儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 oC。
2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物：
將10mL NAD / NADH傳感器緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
注意：此解決方案足以用于兩個96孔板。 任何未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至10μM）：
3.1將10μL的NADH儲備液（來自步驟1）加入990μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，生成10μM稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。
3.2取200μL10μM標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到NADH標(biāo)準(zhǔn)品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續(xù)稀釋液。
3.3如表1和2中所述，將含有NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含NAD / NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
表1白色/透明底96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局
注意：NS = NADH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對照，TS =測試樣品。
表2每個孔的試劑組成
注意：*將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>100μM，濃度）可能由于NADH傳感器的過度氧化而導(dǎo)致信號降低。
4.在上清液反應(yīng)中運行NAD / NADH測定：
4.1將50μLNADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品（來自步驟3.3）的每個孔中，使總NADH測定體積為100μL/孔。
注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時，避光。
4.3用吸光度讀數(shù)儀在575±5 nm或吸光度比為~570 nm至~605 nm下監(jiān)測吸光度的增加，以提高檢測靈敏度。
注1：對于NAD / NADH比率測量，建議使用套件15263。
注2：對于基于細(xì)胞的NAD / NADH測量，建議使用ReadiUse?哺乳動物細(xì)胞裂解緩沖液* 5X *（Cat#20012）裂解細(xì)胞。
數(shù)據(jù)分析
空白孔中的吸光度（僅使用PBS緩沖液）用作對照，并從具有NADH反應(yīng)的那些孔的值中減去。 NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
注意：吸光度背景隨時間增加，因此減去每個數(shù)據(jù)點的空白孔的吸光度非常重要。
圖1.使用NOVOStar（BMG Labtech）酶標(biāo)儀在白色/透明底96孔板中用Amplite TM比色Totlal NAD和NADH測定試劑盒測量NADH劑量反應(yīng)。 在孵育1小時（n = 3）時可以檢測到低至300nM（30pmol /孔）的NADH，而NADPH沒有響應(yīng)。
參考文獻(xiàn)
1. Ziegenhorn J, Senn M, Bucher T. (1976) Molar absorptivities of beta-NADH and beta-NADPH. Clin Chem, 22, 151.
2. Ikegami T, Kameyama E, Yamamoto SY, Minami Y, Yubisui T. (2007) Structure and Properties of the Recombinant NADH-Cytochrome b(5) Reductase of Physarum polycephalum. Biosci Biotechnol Biochem.
3. Kimura N, Fukuwatari T, Sasaki R, Shibata K. (2006) Comparison of metabolic fates of nicotinamide, NAD+ and NADH administered orally and intraperitoneally; characterization of oral NADH. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 52, 142.
4. O'Donnell JM, Kudej RK, LaNoue KF, Vatner SF, Lewandowski ED. (2004) Limited transfer of cytosolic NADH into mitochondria at high cardiac workload. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286, H2237.