基本信息

貨號：15271

儲存條件：保存在冰箱，避光

適用儀器：吸光板酶標儀

簡介

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在細胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite?比色NADH檢測試劑盒為檢測NADH提供了一種便捷的方法。 NADH探針是一種生色傳感器，在NADH減少時具有460nm的極大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite?比色NADH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測低至3μM的NADH。

試劑盒組成

96孔板的檢測分析

簡要概括

準備NADH反應(yīng)混合物（50μL）®

添加NADH標準品或測試樣品（50μL）®

在室溫下孵育15分鐘至2小時®

監(jiān)測460 nm處的吸光度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個

操作步驟

1.準備NADH儲備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol /μL）NADH儲備溶液。

注意：未使用的NADH儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NADH反應(yīng)混合物：

將1mL NADH探針（組分A）加入4mL NADH測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADH反應(yīng)混合物用于一個96孔。未使用的NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADH標準品的連續(xù)稀釋液（0至100μM）：

3.1將100μL的NADH儲備液（來自步驟1）加入400μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，生成200μM（100 pmol / L）NADH標準溶液。注意：稀釋的NADH標準溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

3.2取200μL的200μMNADH標準溶液進行1：2連續(xù)稀釋，得到NADH標準品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續(xù)稀釋液。

3.3如表1和2所述，將NADH標準品和含有NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。注意：根據(jù)需要制備細胞或組織樣品。

表1白色/透明底96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標準品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。

4.在上清液反應(yīng)中運行NADH測定：

4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADH測定體積為100μL/孔

注1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。

注2：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細胞（詳見附錄）。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時，避光。

4.3使用吸光度讀板儀在460 nm處監(jiān)測吸光度的增加。

數(shù)據(jù)分析

空白孔中的吸光度（僅使用PBS緩沖液）用作對照，并從具有NADH反應(yīng)的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。

圖1。 使用SpectraMax酶標儀（Molecular devices），使用Amplite?比色NADH分析試劑盒在96孔白色/透明底板中測量NADH劑量反應(yīng)。孵育30分鐘可檢測到低至3μM的NADH（n = 3） 在460nm處測量吸光度。

附錄：使用組分D（裂解緩沖液）的測試樣品制劑

1.植物細胞樣品：用200mg / mL的裂解緩沖液均質(zhì)化，并以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進行測試。

2.**細胞樣品：離心收集**細胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液，將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉(zhuǎn)速5分鐘，用上清液進行試驗。

3.哺乳動物細胞樣品：從平板孔中取出培養(yǎng)基，每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液（或在96孔細胞培養(yǎng)板中使用50-100μL/孔），并將處理過的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，使用上清液進行測試。

4.組織樣品：稱取約20mg組織，用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進行測定。

參考文獻

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