細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機(jī)制的研究，闡明了一大類**病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致**新療法的出現(xiàn)。除了前兩期談到的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法及試劑外，今天百螢帶您來了解一下其他的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。

其他的細(xì)胞凋亡檢測(cè)

除了檢測(cè)線粒體膜電位的變化或半胱天冬酶活化之外的各種參數(shù)可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。例如，據(jù)報(bào)道，通過直接GSH氧化或從細(xì)胞輸出GSH降低細(xì)胞谷胱甘肽（GSH）濃度是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中的初期。減少GSH是防御自由基和維持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平的關(guān)鍵因素。GSH在胞質(zhì)溶膠中自由分布，并且在線粒體等細(xì)胞器中被分隔。線粒體GSH（mGSH）在修復(fù)和防御由氧化應(yīng)激和不斷產(chǎn)生的活性氧（ROS）引起的損傷中起重要作用。研究表明，mGSH的消耗將引發(fā)線粒體透化和效應(yīng)caspase活化的交替。為了測(cè)量還原GSH的濃度，AAT Bioquest開發(fā)了一種專有的非熒光Thiolite?Green染料，可用于Cell Meter?細(xì)胞內(nèi)GSH檢測(cè)試劑盒。在活的非凋亡細(xì)胞中，綠色熒光強(qiáng)度通過Thiolite?Green在靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠和線粒體中的積累而增加。在凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞中，Thiolite ?Green的熒光強(qiáng)度通過降低的GSH濃度而降低。用Thiolite?Green染色的細(xì)胞可以用流式細(xì)胞儀觀察，并且可以與其他凋亡測(cè)定結(jié)合用于多參數(shù)研究。通過Thiolite?Green在靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠和線粒體中的積累，綠色熒光強(qiáng)度增加。在凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞中，Thiolite?Green的熒光強(qiáng)度通過降低的GSH濃度而降低。用Thiolite?Green染色的細(xì)胞可以用流式細(xì)胞儀觀察，并且可以與其他凋亡測(cè)定結(jié)合用于多參數(shù)研究。（使用Cell Meter?細(xì)胞內(nèi)GSH檢測(cè)試劑盒對(duì)熒光強(qiáng)度變化的實(shí)例數(shù)據(jù)分析可在下面的圖1中找到）

圖1.在Jurkat細(xì)胞中添加喜樹堿后Thiolite?Green的熒光強(qiáng)度降低。Jurkat細(xì)胞進(jìn)行處理過夜，不（藍(lán)線）或在37 20μM喜樹堿（粉紅色線）^? ℃，5％CO ₂培養(yǎng)箱中，然后染料裝載Thiolite?綠色30分鐘。使用FL1通道，用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細(xì)胞儀測(cè)量Thiolite?Green的熒光強(qiáng)度。

通過膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物檢測(cè)細(xì)胞凋亡的早期階段：

檢測(cè)細(xì)胞膜的形態(tài)變化是檢測(cè)活細(xì)胞凋亡過程早期階段的有效方法。通過檢測(cè)細(xì)胞溶質(zhì)磷脂，磷脂酰絲氨酸（PS）的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)這些變化的監(jiān)測(cè)，例如膜對(duì)稱性的喪失。在細(xì)胞凋亡的初始階段，細(xì)胞膜不穩(wěn)定，使PS從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜的外部小葉，在那里它們可以通過膜聯(lián)蛋白檢測(cè)。膜聯(lián)蛋白是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，其優(yōu)先結(jié)合PS。AAT Bioquest公司開發(fā)了一系列與我們的iFluor?染料系列結(jié)合的**Annexin V蛋白。它們共同構(gòu)成PS傳感器，專門與PS結(jié)合，具有出色的光穩(wěn)定性。對(duì)于更靈敏的檢測(cè)或處理小樣本或有限樣本時(shí)，請(qǐng)使用百螢生物的Cell Meter?PS凋亡試劑盒，其中包含Apopxin PS傳感器。Apopxin對(duì)PS的高親和力比其他基于Annexin-V的商業(yè)試劑盒具有更強(qiáng)的分析能力。

下面的圖2是使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet?450與PS在Jurkat細(xì)胞凋亡中的結(jié)合活性的實(shí)例。在活的非凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet?450檢測(cè)非誘導(dǎo)細(xì)胞中的先天性細(xì)胞凋亡，其通常為所有細(xì)胞的2-6％。在凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet?450與PS結(jié)合，PS位于細(xì)胞膜的外部小葉上，導(dǎo)致染色強(qiáng)度增加。

圖2.檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet?450和磷脂酰絲氨酸在Jurkat細(xì)胞中的結(jié)合活性。Jurkat細(xì)胞無（藍(lán)色），或與在37 1個(gè)μM星形孢菌素（紅色）處理^? C，5％CO ₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)后，經(jīng)過染料加載用膜聯(lián)蛋白V-mFluor紫?450 30分鐘。使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細(xì)胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測(cè)量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet?450的熒光強(qiáng)度。

如需更多關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究，請(qǐng)您咨詢百螢生物，您可以獲得關(guān)于細(xì)胞凋亡的全部資料，資料包括監(jiān)測(cè)DNA片段化和縮合，細(xì)胞壞死測(cè)定，自噬測(cè)定等，檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程晚期的檢測(cè)方法。

涉及到的產(chǎn)品信息

百螢生物是AAT Bioquest的中國總代理商，為國內(nèi)提供AAT的上等產(chǎn)品以及各類產(chǎn)品定制、售后技術(shù)服務(wù)，歡迎咨詢！