細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個熱點，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機(jī)制的研究，闡明了一大類**病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致**新療法的出現(xiàn)。Caspase家族在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，今天百螢帶你來了解一下Caspase家族與細(xì)胞凋亡千絲萬縷的聯(lián)系。
Caspase：
概念：Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是活性位點都含有半胱氨酸，并特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase一詞是從Cysteine aspartic acid specific protease 的字頭縮寫衍生而來，就反映了這個特征，而這種高度的特異性，在蛋白酶中是很少見的。
機(jī)制：半胱天冬酶是細(xì)胞質(zhì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，其作為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。它們的活化受Bcl-2和IAP蛋白家族成員的調(diào)節(jié)。在接收外部或內(nèi)在死亡信號后刺激活化，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銜接子分子聚集在受體相關(guān)細(xì)胞溶質(zhì)復(fù)合物上的procaspase。procaspase的聚集通過二聚化或二聚化然后自身蛋白水解切割啟動胱天蛋白酶活化。*初的半胱天冬酶活化導(dǎo)致額外的半胱天冬酶蛋白水解直觀地擴(kuò)增半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)。
細(xì)胞凋亡啟動子半胱天冬酶及其各自的分析
根據(jù)它們在半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)中的作用，半胱天冬酶進(jìn)一步細(xì)分為凋亡啟動子半胱天冬酶和凋亡效應(yīng)半胱天冬酶。凋亡啟動子半胱天冬酶如胱天蛋白酶-2，-8，-9和-10可以啟動半胱天冬酶激活級聯(lián)反應(yīng)。例如，胱天蛋白酶-8對于誘導(dǎo)死亡的信號傳導(dǎo)復(fù)合物（DISC）的形成是必需的，并且當(dāng)激活時，半胱天冬酶-8激活下游效應(yīng)子半胱天冬酶。已證明胱天蛋白酶-8對IETD肽序列顯示出相對高的底物選擇性。百螢生物利用這種酶 - 底物相互作用開發(fā)出有效且穩(wěn)定的試劑盒，用于檢測caspase-8活性。
百螢生物提供三種選擇的Cell Meter?Caspase 8活性細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，可與不同的過濾器兼容。每個試劑盒含有獨特的熒光指示劑，其由與底物選擇性IETD肽序列綴合的特定熒光發(fā)色團(tuán)AMC，R110或ProRed TM組成。該測定可以容易地優(yōu)化用于高通量篩選并且量化凋亡細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶-8的活性或篩選半胱天冬酶8抑制劑。
細(xì)胞凋亡效應(yīng)Caspase及其各自的檢測
細(xì)胞凋亡效應(yīng)caspase如caspase-3，-6和-7可能不是啟動級聯(lián)途徑的原因，但是當(dāng)它們被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。例如，caspase-3是一種關(guān)鍵的效應(yīng)因子，因為它可以放大來自啟動子半胱天冬酶的信號，并且表示完全致力于細(xì)胞分解。使用DEVD肽序列進(jìn)行活化的胱天蛋白酶-3的檢測，所述DEVD肽序列對胱天蛋白酶-3具有選擇性，并證明在開發(fā)胱天蛋白酶-3底物方面是成功的。百螢生物提供兩套獨特的試劑盒，用于檢測caspase-3/7活性：Amplite?熒光Caspase 3/7檢測試劑盒和Cell Meter?Caspase 3/7活性細(xì)胞凋亡試劑盒。
Amplite?熒光Caspase 3/7檢測試劑盒有三種選擇。每個試劑盒都含有一個用熒光發(fā)色團(tuán)AMC，R110或ProRed?修飾的caspase-3選擇性DEVD肽序列，每個序列都有其獨特的優(yōu)勢?；赯-DEVD-R110的半胱天冬酶底物由于其兩步裂解過程而表現(xiàn)出較窄的動態(tài)范圍。它們比基于香豆素的半胱天冬酶底物更敏感，推薦用于終點分析?；贏MC和AFC的半胱天冬酶底物*適合動力學(xué)測定。雖然我們的ProRed?-DEVD基板具有更長的激發(fā)和發(fā)射波長，因此它們對于篩選caspase3 / 7抑制劑非常有用。
Cell Meter?Caspase 3/7活性細(xì)胞凋亡試劑盒也有三種選擇，每種都有熒光指示劑底物，用不同的熒光發(fā)色團(tuán)修飾。這些試劑盒旨在通過測量caspase-3活化來監(jiān)測細(xì)胞凋亡。它們耐用性很高、適用范圍很廣，可以很容易地適用于各種熒光平臺（如微孔板分析）中的高通量測定。
信號通路用于細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡傳統(tǒng)上被認(rèn)為是不可逆的過程，因此細(xì)胞凋亡的起始必須通過特定的激活機(jī)制嚴(yán)格調(diào)節(jié)。兩種*廣泛研究和理解的細(xì)胞凋亡激活機(jī)制是外在和內(nèi)在途徑。百螢生物的caspase檢測試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，可檢測和分析半胱天冬酶的活化，因為它們將凋亡信號傳遞到外源或內(nèi)源途徑。
外在途徑：
負(fù)責(zé)啟動細(xì)胞凋亡的外源凋亡信號傳導(dǎo)途徑使用腫瘤壞死因子（TNF）受體與其相應(yīng)配體或死亡受體之間的跨膜受體介導(dǎo)的相互作用。TNF受體由富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和80個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。死亡受體及其相應(yīng)配體的二聚化激活受體復(fù)合物以開始凋亡信號的透射。在二聚化時，銜接蛋白如FADD的募集引發(fā)胱天蛋白酶原-8募集至死亡誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。procaspase-8寡核苷酸化至死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物導(dǎo)致蛋白水解切割和胱天蛋白酶-8活化。（對于外在途徑機(jī)制，請參考下面的圖1）
圖1.顯示外在和內(nèi)在的凋亡信號傳導(dǎo)途徑
半胱天冬酶結(jié)合測定在檢測負(fù)責(zé)啟動細(xì)胞凋亡的外在信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵事件方面是極好的，例如啟動子和效應(yīng)子半胱天冬酶的活化。百螢生物提供**的Cell Meter?活細(xì)胞半胱天冬酶結(jié)合試劑盒系列，使用熒光細(xì)胞滲透和無毒指示劑檢測caspase-1，-2，-3 / 7，-6，-8，-9，-10和13活動。在與其適當(dāng)?shù)陌腚滋於附Y(jié)合后，熒光試劑保留在細(xì)胞內(nèi)。該結(jié)合事件阻止半胱天冬酶的任何進(jìn)一步催化而不停止細(xì)胞凋亡過程。這些半胱天冬酶結(jié)合試劑盒適用于熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀和熒光微板讀數(shù)器。半胱天冬酶測定可以與其他細(xì)胞凋亡測定結(jié)合進(jìn)行，以闡明外在和內(nèi)在凋亡途徑之間的任何關(guān)系。例如，使用半胱天冬酶結(jié)合測定結(jié)合檢測線粒體膜電位變化的測定法可以揭示外在和內(nèi)在凋亡信號傳導(dǎo)途徑之間的任何潛在的“串?dāng)_”。
內(nèi)在途徑：
內(nèi)源性凋亡信號傳導(dǎo)途徑由線粒體信號傳導(dǎo)蛋白介導(dǎo)。它的功能是響應(yīng)各種類型的細(xì)胞內(nèi)刺激，如DNA損傷，生長因子戒斷和死亡受體刺激。接收細(xì)胞內(nèi)刺激激活促凋亡蛋白，例如BH3相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動劑或BID。Bcl-2家族的其他成員，如Bax，與BID蛋白相互作用，允許它們插入線粒體外膜。線粒體膜不穩(wěn)定，允許形成線粒體凋亡誘導(dǎo)的通道，其促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c是促凋亡因子，其與蛋白質(zhì)凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）相互作用，其募集胱天蛋白酶原-9以形成凋亡體復(fù)合物。該復(fù)合物的形成裂解并激活凋亡引發(fā)劑caspase-9以啟動半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，*終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（對于外在途徑機(jī)制，請參考上面的圖1）
檢測線粒體膜電位（MMP）的變化是內(nèi)在激活細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。百螢生物開發(fā)了專有的陽離子線粒體探針，可靈敏地檢測靶細(xì)胞線粒體膜電位的任何變化。這些專有探針可作為百螢生物的Cell Meter?MMP檢測試劑盒中的關(guān)鍵組分，用于監(jiān)測細(xì)胞活力。在正常細(xì)胞中，這些線粒體探針發(fā)出紅色熒光，其信號強(qiáng)度與線粒體內(nèi)積累的探針量成比例。能夠在線粒體內(nèi)積聚的探針越多，發(fā)出的熒光信號越強(qiáng)烈。然而，在凋亡細(xì)胞中，在MMP崩潰后，線粒體染料的熒光強(qiáng)度減弱，表明細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡的caspase級聯(lián)反應(yīng)。這些試劑盒已經(jīng)過單獨優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡和熒光和流式細(xì)胞儀檢測中的凋亡激活劑和抑制劑的篩選。該試劑盒可與其他試劑結(jié)合使用，如Cell Meter?磷脂絲胺酸細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，用于細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的多參數(shù)研究。