AF660馬來酰亞胺實(shí)驗(yàn)方案
溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性等分，并在配制后儲(chǔ)存在-20°C下。避免反復(fù)凍融。
1.蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）
將100μL反應(yīng)緩沖液（例如pH~6.0的100mM MES緩沖液）與900μL蛋白溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。
注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為6.5±0.5。
注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白穩(wěn)定的抗體不能很好地被標(biāo)記
注意：蛋白質(zhì)濃度低于2mg/mL，偶聯(lián)效率會(huì)顯著降低。為了獲得好的標(biāo)記效率，建議結(jié)束蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10mg/mL。
2.染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）
將無水DMSO加入XFD660 馬來酰亞胺小瓶中，制成10mM儲(chǔ)備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。
注意：開始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）并及時(shí)使用。染料儲(chǔ)備溶液長時(shí)間儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲(chǔ)存4周。避免反復(fù)凍融。
3.可選
如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱氨酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質(zhì)生成硫醇基團(tuán)。 DTT 或 TCEP 將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在馬來酰亞胺染料與蛋白質(zhì)結(jié)合之前，通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1M DTT (15.4 mg/100 μL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液添加 20 μL DTT儲(chǔ)備液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。
3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液”預(yù)平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的組分合并?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法來完成。
此步驟后盡快進(jìn)行綴合（參見示例實(shí)驗(yàn)方案）。
注意： 為了獲得好的結(jié)果，IgG 溶液得濃度應(yīng) >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)進(jìn)行濃縮。另外，需要增加 10% 來補(bǔ)償在緩沖液交換柱上的損失。
注意：還原反應(yīng)可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟3和4可以用透析代替。
樣品實(shí)驗(yàn)方案
（該方案適用于山羊抗小鼠IgG與XFD 660 馬來酰亞胺的偶聯(lián)物標(biāo)記。）
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物會(huì)降低靈敏度。
進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)
1.使用10:1的摩爾比率（溶液B（染料）/A（蛋白質(zhì)））作為起點(diǎn)：將5μL染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入蛋白質(zhì)溶液（95μL溶液A）的小瓶中并充分搖晃。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL，蛋白質(zhì)分子量為~200KD，則蛋白質(zhì)濃度為~0.05 mM。
注意：建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比為10:1。如果太少或太高，可以嘗試5:1、15:1和20:1來確定合適的染料/蛋白質(zhì)比。
2.在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
純化偶聯(lián)
（以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料蛋白偶聯(lián)物的一個(gè)例子）
1.按照產(chǎn)品說明準(zhǔn)備Sephadex G-25柱。
2.將“進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)”步驟中的反應(yīng)混合物裝入Sephadex G-25柱的頂部。
3.當(dāng)樣品剛低于頂部樹脂表面時(shí)，立即加入PBS（pH 7.2-7.4.）。
4.向樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子純化。將含有目標(biāo)染料-蛋白質(zhì)綴合物的組分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白質(zhì)綴合物物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝。
注意：為了長期儲(chǔ)存，染料蛋白綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
表征所需的染料-蛋白質(zhì)綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的關(guān)鍵因素。 DOS 較低的蛋白質(zhì)通常熒光強(qiáng)度較弱，而 DOS 較高的蛋白質(zhì)也可能熒光強(qiáng)度減弱。對(duì)于大多數(shù)抗體，建議DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的特性。為了有效標(biāo)記，DOS 應(yīng)控制為每摩爾抗體含有 5-8 摩爾 XFD660 馬來酰亞胺。以下步驟概述了如何確定 XFD660 馬來酰亞胺標(biāo)記蛋白的 DOS。
檢測(cè)吸收率
要測(cè)量染料-蛋白質(zhì)綴合物的吸收光譜，請(qǐng)將樣品濃度保持在 1 至 10 μM 之間。該范圍內(nèi)的確切濃度取決于染料的消光系數(shù)。
在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料吸光度（對(duì)于 XFD660 染料，?max = 663 nm）
對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，用去離子水稀釋樣品（來自柱餾分），直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)的吸光度為 280 nm，而 XFD660 馬來酰亞胺的吸光度為 663 nm。為了確保讀數(shù)準(zhǔn)確，請(qǐng)確保結(jié)合物不含任何非結(jié)合染料。